本文摘要：MTT原理　　MTT全称作3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学取名为3-(4，5-mtt二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：mtt噻唑蓝。

MTT原理　　MTT全称作3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学取名为3-(4，5-mtt二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：mtt噻唑蓝。是一种朱颜色的染料。

　　MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原成为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而杀细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能沉淀细胞中的甲瓒，用酶联成免疫系统检测仪在490nm波长处测量其光吸收值，可间接体现活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶构成的量与细胞数成正比。该方法已普遍用作一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物检验、细胞毒性试验以及肿瘤放射线敏感性测量等。它的特点是灵敏度低、经济。

　　缺点：由于MTT经还原成所产生的甲瓒产物不水溶液水，须要被沉淀后才能检测。这不仅使工作量减少，也不会对实验结果的准确性产生影响，而且沉淀甲的有机溶剂对实验者也有伤害。

　　MTT溶液的提炼方法　　一般来说，此法中的MTT浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT0.5克，水溶液100ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚白的培养基中，用0.22m滤膜过滤器以除去溶液里的细菌，敲4℃避光留存才可。在提炼和留存的过程中，容器最差用铝箔纸撕开。

实验的时候我一般重开超净台上的日光灯来避光，实在这样较为好。　　必须留意的是，MTT法不能用来检测细胞相对数和比较活力，但无法测量细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了确保实验结果的线性，MTT吸食光度最差在0-0.7范围内。　　MTT一般最差现用现配，过滤器后4oC避光留存两周内有效地，或提炼成5mg/ml留存在-20度长年留存，防止重复冻融，最差小剂量填装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸撕开避光以免分解成。

我一般都把MTT粉填装在EP管里，用的时候现配，必要往培育板中加，没有适当一下子配上那么多,特别是在当MTT变成灰绿色时就意味著无法再用了。　　MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最差带上那种半透明的簿膜手套.配制的MTT必须无菌，MTT对菌很脆弱;往96孔板加时不避光也没关系，却是时间较短，或者你不安心的时候可以把操作者台上的照明灯开动.　　提炼MTT时用PBS(ph=7.4)沉淀。PBS配方：Nacl8g+Kcl0.2g+Na2HPO41.44g+KH2PO40.24g调pH7.4,定容1L。　　普通MTT法实验步骤：　　1：疫苗细胞：用含10%胎小牛血清得培养液配制单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞疫苗到96孔板，每孔体积200ul.　　2:培育细胞：同一般培育条件，培育3-5天(可根据试验目的和拒绝要求培育时间)。

　　3：呈色：培育3-5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS提炼，pH=7.4)20ul.之后孵育4h，　　中止培育，小心吸弃孔内培育上清液，对于漂浮细胞必须离心后再行吸弃孔内培育上清液。每孔加150ulDMSO，波动10min，使结晶物充份融化。　　4：比色：自由选择490nm波长，在酶联成免疫系统监测仪上测量各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

　　药物MTT法实验步骤　　贴壁细胞：　　1:搜集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔重新加入100ul,铺板使待测细胞徵密度1000-10000孔，(边缘孔用无菌PBS填满)。　　2:5%CO2，37℃孵育，至细胞单层布满孔底(96孔平底板),重新加入浓度梯度的药物,应以，细胞贴壁后才可特药，或两小时，或半天时间，但我们经常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则无法反应真实情况　　3:5%CO2，37℃孵育16-48小时，长条显微镜下仔细观察。　　4:每孔重新加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，之后培育4h。若药物与MTT需要反应，可再行离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再行重新加入含MTT的培养液。

　　5:中止培育，小心吸去孔内培养液。　　6:每孔重新加入150ul二甲基亚砜，置摇床上短距离波动10min，使结晶物充份沉淀。在酶联成免疫系统检测仪OD490nm一处测量各孔的吸光值。

　　7:同时设置徵零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、完全相同浓度的药物沉淀介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

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